AML (Akut Miyeloid Lösemi) Paneli

AML  Paneli, yeni tanı akut miyeloid lösemi (AML) olgularında sitogenetik ve moleküler bulguların bütünleşik olarak değerlendirilmesi; WHO-HAEM5/ICC sınıflaması, erişkin AML’de tedavi yaklaşımına göre ELN 2022 veya ELN 2024 Less-Intensive genetik risk grubu, pediatrik AML’de ise kullanılan tedavi protokolüne özgü risk sınıflaması ve klinik açıdan anlamlı hedeflerin belirlenmesine katkı sağlamak amacıyla oluşturulmuş bir test yaklaşımıdır.

AML genetik olarak heterojen bir hastalık grubudur. Kromozomal yeniden düzenlenmeler, anöploidi/kopya sayısı değişiklikleri ve gen düzeyindeki varyantlar tanımlayıcı, prognostik veya tedaviyle ilişkili olabilir. Bu nedenle farklı yöntemlerin birlikte değerlendirilmesi önemlidir.

 Paneli kapsamında birbirini tamamlayan farklı genetik yöntemler birlikte kullanılmaktadır:

• Kromozom analizi ile kromozom sayısı, kompleks/monozomal karyotip ve sitogenetik çözünürlükte saptanabilen (>10 MB) büyük yapısal kromozom değişiklikleri,
• Hızlı FISH analizleri ile özellikle PML::RARA, RUNX1::RUNX1T1, CBFB::MYH11, KMT2A, MECOM ve BCR::ABL1 ilişkili yeniden düzenlenmeler,
• RNA-NGS/WTS ile geniş füzyon/yeniden düzenlenme analizi ile WHO/ICC tanımlayıcı ve nadir/kriptik AML ilişkili füzyonlar,
• DNA-NGS / Klinik Panel ile NPM1, FLT3, CEBPA (özellikle bZIP bölgesindeki in-frame varyantlar; WHO-HAEM5 açısından biallelik CEBPA değişiklikleri de dikkate alınır), TP53, myelodisplazi ilişkili genler, IDH1/2, GATA1/GATA2 ve diğer AML ilişkili SNV/indeller; valide kapsamda CNV bulguları,
• Hızlı moleküler çekirdek kapsamında FLT3-ITD hedefli PCR + kapiller elektroforez/fragment analizi ile; FLT3-TKD, NPM1, IDH1 ve IDH2 ise NGS ile erken dönemde değerlendirilir. Valide DNA-NGS tabanlı CNV bulguları karyotiple birlikte yorumlanır.

Bu yöntemlerin birlikte kullanılması, tek bir yöntemle gösterilemeyecek farklı genetik değişikliklerin daha kapsamlı araştırılmasına ve tanı, risk sınıflaması, hedeflenebilirlik ve izlem planının bütüncül değerlendirilmesine olanak sağlar.

Hızlı Moleküler Çekirdek: FLT3-ITD/FLT3-TKD/NPM1/IDH1/IDH2

AML’de NPM1, FLT3 ve IDH1/2 değişiklikleri tanı, risk değerlendirmesi ve tedavi planlaması açısından erken sonuç gerektirebilir. Bu nedenle  kapsamında geniş DNA-NGS / Klinik Panel sonucu beklenmeden hızlı moleküler çekirdek değerlendirmesi planlanır. Laboratuvar iş akışında FLT3-ITD hedefli PCR + kapiller elektroforez/fragment analizi ile; FLT3-TKD, NPM1, IDH1 ve IDH2 ise NGS ile değerlendirilir. DNA-NGS / Klinik Panel verileri bu genler açısından ayrıca bütüncül olarak değerlendirilir. Erişkin AML’de yoğun tedavi için ELN 2022; HMA-temelli daha az yoğun tedaviler için ELN 2024 Less-Intensive risk çerçevesi dikkate alınmalıdır. FLT3-ITD allelik oranı ELN 2022 risk kategorisini belirlemek için kullanılmamaktadır; pediatrik AML’de FLT3-ITD ve diğer genetik göstergelerin riskteki ağırlığı kullanılan protokole göre değişebileceğinden, gerekli ölçütler protokol gereksinimine uygun biçimde raporlanmalıdır.

Genetik Alt Tiplerin Sınıflamadaki Yeri

WHO-HAEM5 ve ICC AML sınıflamasında PML::RARA, RUNX1::RUNX1T1, CBFB::MYH11, DEK::NUP214, BCR::ABL1, KMT2A, MECOM ve NUP98 yeniden düzenlenmeleri ile NPM1 ve CEBPA değişiklikleri tanımlayıcı genetik olaylar arasında yer alır. Sınıflamalar ayrıntıda farklılık gösterebilir: ICC, TP53-mutasyonlu AML’yi ayrı bir kategori olarak ele alır ve myelodisplazi ilişkili gen mutasyonları grubuna RUNX1’i de dahil eder; WHO-HAEM5’te TP53 ayrı bir AML entitesi değildir ve AML-MR mutasyon setinde RUNX1 yer almaz. CEBPA açısından ICC monoallelik veya biallelik in-frame bZIP varyantlarını; WHO-HAEM5 ise biallelik CEBPA değişikliklerini veya tek bZIP CEBPA mutasyonunu tanımlayıcı kabul eder. Blast eşiği de sınıflamaya göre farklıdır: WHO-HAEM5, BCR::ABL1 ve CEBPA tanımlı AML için ≥%20 blast isterken diğer çoğu tanımlayıcı genetik olayda sabit bir alt eşik kullanmaz; ICC ise BCR::ABL1 dışında recurrent-genetic AML alt tiplerinde genellikle ≥%10 blast, BCR::ABL1 için ≥%20 blast eşiğini kullanır. BCR::ABL1 saptanan olgularda CML’nin myeloid blast fazı klinik, morfolojik, sitogenetik ve moleküler verilerle dışlanmalıdır. Genetik bulgular morfoloji, blast oranı, klinik öykü ve sitogenetik verilerle birlikte hiyerarşik olarak yorumlanmalıdır.

Erişkin ve Pediatrik Risk Değerlendirmesi

WHO-HAEM5 ve ICC sınıflama ilkeleri erişkin ve pediatrik AML’nin genetik tanımlanmasında kullanılabilir; ancak prognostik risk sınıflaması yaş grubuna ve tedavi protokolüne göre farklılaşır. Erişkin AML’de yoğun kemoterapi alan hastalar için ELN 2022 genetik risk sistemi; HMA monoterapisi, HMA-venetoklaks veya uygun IDH1-mutasyonlu olgularda azasitidin-ivosidenib gibi daha az yoğun HMA-temelli tedaviler için ELN 2024 Less-Intensive sınıflaması dikkate alınmalıdır. ELN 2024 Less-Intensive sınıflaması önceki HMA maruziyeti olan hastalar için geliştirilmemiştir. Pediatrik AML’de risk ataması kullanılan pediatrik protokolün genetik ve MRD ölçütlerine göre yapılmalıdır. Pediatrik AML’de özellikle NUP98 yeniden düzenlenmeleri, CBFA2T3::GLIS2, belirli KMT2A füzyon partnerleri, DEK::NUP214 ve diğer çocukluk çağında zenginleşmiş füzyonlar klinik risk açısından önem taşıyabilir. Bu nedenle pediatrik olgularda füzyon partnerinin mümkün olduğunca tanımlanması ve sonuçların ilgili tedavi protokolü ile birlikte yorumlanması gerekir. Hedefe yönelik tedavi seçeneklerinin klinik kullanımı da yaş, ruhsat durumu ve protokole göre değişebilir.

Pediatrik AML'de Özel Durumlar

Trizomi 21/Down sendromu ile ilişkili transient abnormal myelopoiesis veya myeloid lösemi şüphesinde GATA1 mutasyon analizi özellikle önemlidir ve bu olgular farklı hastalık biyolojisi ve tedavi yaklaşımına sahiptir. Down sendromu olmayan akut megakaryoblastik lösemi ve genetik olarak açıklanamayan pediatrik AML olgularında CBFA2T3::GLIS2, NUP98 füzyonları, KMT2A yeniden düzenlenmeleri ve diğer kriptik yapısal değişiklikler açısından RNA-temelli geniş füzyon analizi önem taşır.  kapsamında uygulanan DNA-NGS Full CDS ve RNA-WTS analizleri ile açıklanamayan seçilmiş pediatrik olgularda, klinik gereksinime göre daha kapsamlı genomik yapısal varyant analizi ve/veya WGS değerlendirilebilir. UBTF tandem duplikasyonları ve bazı BCL11B non-kodlayıcı düzenleyici/yapısal olayları mevcut  yöntemleriyle eksiksiz olarak saptanamayabilir. BCL11B ile ilişkili olaylarda WTS, füzyon transkripti ve/veya anormal gen ekspresyonunun gösterilmesi açısından destekleyici olabilir.

Ek/İleri Moleküler Değerlendirmeler Ne Zaman Gereklidir?

Paneli ile elde edilen bulgulara, kullanılan tedavi protokolüne, örnek özelliklerine ve hastanın klinik gereksinimlerine göre seçilmiş olgularda hızlı doğrulama, hedefe yönelik ek analizler veya daha ileri moleküler/genomik değerlendirmeler gerekebilir.

Moleküler MRD İzlemi

AML’de tedaviye verilen yanıtın hassas şekilde izlenmesi önemlidir. NPM1 mutasyonu, PML::RARA, RUNX1::RUNX1T1 ve CBFB::MYH11 gibi valide moleküler belirteçler uygun hastalarda MRD takibi için kullanılabilir. Tanıda saptanan izlenebilir moleküler hedefler, uygun olgularda bazal kantitatif düzey belirlenerek tedavi sırasında ve sonrasında seri moleküler MRD takibinde kullanılabilir. Seri MRD ölçümleri AML  tanı panelinden ayrı takip testleri olarak planlanır.

Moleküler hedef bulunmayan veya standartlaştırılmış moleküler izlemin uygun olmadığı olgularda MRD değerlendirmesi başta çok parametreli akım sitometri olmak üzere klinik protokole uygun yöntemlerle planlanır.

Moleküler MRD için NPM1, PML::RARA, RUNX1::RUNX1T1, CBFB::MYH11 ve uygun/valide olgularda seçilmiş KMT2A yeniden düzenlenmeleri gibi lösemiye özgü hedefler önceliklidir. DNMT3A, TET2 ve ASXL1 (DTA) mutasyonları remisyon sırasında klonal hematopoezi yansıtarak kalıcı olabileceğinden tek başına MRD belirteci olarak yorumlanmamalıdır. Erişkin AML’de 2025 ELN-DAVID MRD güncellemesi doğrultusunda, FLT3-ITD pozitif ve yoğun tedavi alan olgularda FLT3-ITD’ye yönelik MRD değerlendirmesi, özellikle iki tedavi siklusu sonrasında ve allo-HCT öncesinde, yüksek duyarlılıklı valide NGS tabanlı yöntemlerle yapılmalıdır. Tedavi sonu ve takip döneminde de klinik gereksinime göre değerlendirilebilir. Tanıda kullanılan rutin FLT3-ITD hedefli PCR + kapiller elektroforez/fragment analizi yaklaşımı, MRD düzeyindeki düşük hastalık yükünü güvenilir biçimde saptamak için yeterli analitik duyarlılığa sahip değildir. Pediatrik AML’de MRD yöntemi, eşikleri ve zaman noktaları kullanılan tedavi protokolüne göre belirlenmeli; moleküler MRD ve çok parametreli akım sitometrisi protokole uygun biçimde birlikte yorumlanmalıdır.

Takip, Refleks ve Ek/İleri Değerlendirmeler Nedir?

Bazı moleküler takip, refleks ve ek/ileri değerlendirmelerin tüm hastalara başlangıçta uygulanması gerekli değildir.  Paneli sonucuna, morfoloji/immünfenotipe, tedavi yanıtına veya ortaya çıkan klinik gereksinime göre bu testler takip sürecinde veya ikinci aşamada planlanabilir.

PML::RARA Pozitif APL'de Moleküler İzlem Hazırlığı

PML::RARA pozitif APL olgularında, sonraki moleküler MRD izleminin doğru planlanabilmesi için PML::RARA transkript tipinin ve uygun valide yöntemle tanısal bazal kantitatif düzeyin belirlenmesi önerilir.

PML::RARA Negatif APL/APL-Benzeri Şüphesinde

Morfoloji ve immünfenotip akut promiyelositik lösemiyi düşündürdüğü halde PML::RARA FISH/standart analiz negatif veya teknik olarak yetersiz ise:

• PML::RARA için hızlı alternatif moleküler doğrulama (RT-PCR/RNA tabanlı yöntem) planlanabilir,
• RARA ile birlikte RARB/RARG ve ilişkili nadir füzyonlar geniş RNA-NGS / WTS verileri üzerinden değerlendirilebilir.

Bu yaklaşım, klasik PML::RARA dışındaki APL-benzeri genomik olayların ve kriptik yeniden düzenlenmelerin araştırılmasına katkı sağlayabilir.

BCR::ABL Pozitif Myleoid Neoplazide

BCR::ABL1 saptanan myeloid olgularda de novo BCR::ABL1-pozitif AML ile CML’nin myeloid blast fazı ayrımı klinik öykü, önceki kan sayımları, splenomegali, bazofili, blast oranı, sitogenetik/moleküler bulgular ve gerektiğinde ek değerlendirmeler birlikte kullanılarak yapılmalıdır. BCR::ABL1 sonucu tek başına de novo AML tanısı koydurmaz; sınıflama erişkin ve pediatrik olgularda klinik bağlamla birlikte yapılmalıdır.

Karyotip Başarısız/Yetersiz Olduğunda

Analiz edilebilir yeterli metafaz elde edilemeyen olgularda, RUNX1::RUNX1T1, CBFB::MYH11, KMT2A ve MECOM gibi yeniden düzenlenmeler  kapsamında RNA-WTS ile; 5q, 7q ve 17p kayıpları gibi kopya sayısı değişiklikleri ise DNA-NGS kapsamında valide CNV analizi ile değerlendirilir. Klinik olarak hızlı sonuç gerektiren, teknik olarak şüpheli veya ortogonal doğrulama gerektiren seçilmiş durumlarda hedefe yönelik FISH ayrıca kullanılabilir.

Germline Yatkınlık Şüphesinde

DDX41, RUNX1, GATA2, CEBPA, ANKRD26, ETV6 ve benzeri kalıtsal miyeloid neoplazi yatkınlığı ile ilişkili genlerde klinik açıdan anlamlı bir bulgu saptanması; genç yaş, aile öyküsü veya uyumlu klinik özellikler bulunması halinde germline köken ayrıca değerlendirilmelidir.

Germline doğrulama için hematopoietik kontaminasyonu en aza indiren uygun normal doku tercih edilmeli; kan/kemik iliği örneğindeki varyant tek başına germline kabul edilmemelidir.

Bütüncül Değerlendirme

AML  Paneli ile klinik veya teknik gereksinime göre uygulanan takip/MRD değerlendirmeleri, refleks analizler ve ek/ileri moleküler incelemeler birlikte değerlendirildiğinde; AML’nin genetik alt tipinin tanımlanması, erişkin AML’de tedavi yaklaşımına göre ELN 2022 veya ELN 2024 Less-Intensive ve pediatrik AML’de protokol-spesifik risk sınıflamasına katkı sağlanması, hedeflenebilir moleküler değişikliklerin araştırılması, olası germline yatkınlığın fark edilmesi ve uygun olgularda moleküler MRD izleminin planlanması için bütüncül bir yaklaşım sağlanması amaçlanmaktadır. Her hastada tüm takip, refleks ve ek/ileri incelemelerin uygulanması gerekli değildir. Bu değerlendirmeler başlangıç bulguları, tedavi protokolü, tedavi yanıtı ve hastanın klinik gereksinimleri doğrultusunda ilgili hekim ve laboratuvar uzmanları tarafından planlanır.