B-ALL Temel Paneli, yeni tanı B-Hücreli akut lenfoblastik lösemi (B-ALL) olgularında sitogenetik ve moleküler bulguların bütünleşik olarak değerlendirilmesi amacıyla oluşturulmuş bir test yaklaşımıdır.

B-ALL tek bir hastalık değildir. Lösemi hücrelerinde farklı kromozomal ve moleküler değişiklikler bulunabilir. Bu değişikliklerin belirlenmesi; hastalığın moleküler alt tipinin tanımlanmasına, prognostik risk değerlendirmesine ve bazı hastalarda hedefe yönelik tedavi seçeneklerinin belirlenmesine katkı sağlayabilir.

Temel Panel kapsamında birbirini tamamlayan farklı genetik yöntemler birlikte kullanılmaktadır:

• Kromozom analizi ile ploidi, kompleks karyotip ve sitogenetik çözünürlükte saptanabilen (>10 MB) büyük yapısal kromozom değişiklikleri,
• FISH analizleri ile B-ALL açısından önemli belirli kromozomal yeniden düzenlenmeler,
• RNA-NGS/WTS ile geniş füzyon/yeniden düzenlenme analizi; güncel B-ALL moleküler alt tipleri ve özellikle kinaz aktive edici füzyonlar,
• DNA-NGS ile lösemi ilişkili SNV/indel ve valide kapsamda CNV analizi; PAX5 p.P80R ve IKZF1 p.N159Y gibi mutasyonla tanımlanan alt tipler dahil gen düzeyindeki değişiklikler,
• MLPA analizi ile özellikle IKZF1, PAX5, CDKN2A/B ve ilişkili bölgelerdeki kopya sayı değişiklikleri değerlendirilir.

Bu yöntemlerin birlikte kullanılması, tek bir yöntemle gösterilemeyecek farklı genetik değişikliklerin daha kapsamlı şekilde araştırılmasına olanak sağlar.

B-ALL Plus Paneli, Temel Panelin tüm bileşenlerine ek olarak IG/TR klonal hedef analizi ile moleküler MRD hazırlığını içerir. Seri MRD ölçümleri ayrı takip testleri olarak planlanır.

Genetik Alt Tiplerin Sınıflandırmadaki Yeri

WHO-HAEM5 ve ICC, B-ALL/LBL sınıflamasında ploidi değişiklikleri ve tekrarlayan genetik sürücüleri temel alır. BCR::ABL1, KMT2A yeniden düzenlenmeleri, ETV6::RUNX1, TCF3::PBX1, yüksek hiperdiploidi, hipodiploidi/near-haploidi, iAMP21, IGH::IL3 ve TCF3::HLF gibi yerleşik alt gruplara ek olarak DUX4, MEF2D, ZNF384/ZNF362, NUTM1 ve MYC ilişkili yeniden düzenlenmeler ile PAX5 p.P80R gibi yeni moleküler alt tipler tanımlanmıştır. ICC ayrıca IKZF1 p.N159Y ve CDX2/UBTF grubunu tanımlar ve BCR::ABL1-benzeri B-ALL’yi ABL-class rearranged, JAK-STAT activated ve NOS alt gruplarına ayırır. BCR::ABL1-pozitif olgularda lymphoid-only ve multilineage tutulum ayrımı klinik açıdan önem taşıyabilir. ETV6::RUNX1-like, PAX5-altered ve bazı BCR::ABL1-like/DUX4 ilişkili olguların kesin sınıflaması gen ekspresyon profili ve/veya bütünleşik genomik değerlendirme gerektirebilir; Panel bu sürücülerin önemli bölümünü araştırmakla birlikte tüm WHO/ICC alt tiplerinin eksiksiz sınıflandırılmasını garanti etmez.

Ek/İleri Moleküler Değerlendirmeler Ne Zaman Gereklidir?

Temel Panel ile elde edilen bulgulara, kullanılan tedavi protokolüne, örnek özelliklerine ve hastanın klinik gereksinimlerine göre seçilmiş olgularda hızlı doğrulama, hedefe yönelik ek analizler veya daha ileri moleküler/genomik değerlendirmeler gerekebilir.

IKZF1plus Değerlendirmesi

IKZF1plus profili, kullanılan protokoldeki tanıma göre yorumlanmalıdır. Klasik MLPA-temelli tanımda IKZF1 delesyonuna PAX5, CDKN2A, homozigot CDKN2B ve/veya PAR1 bölgesi delesyonlarından en az birinin eşlik etmesi ve ERG delesyonunun bulunmaması beklenir. MLPA P335 ALL-IKZF1; IKZF1, PAX5, CDKN2A/B, PAR1 ve ilişkili bölgeleri değerlendirir ancak ERG delesyonunu kapsamaz. Bu nedenle formal IKZF1plus sınıflaması yapılacaksa ERG durumu ayrı ve valide bir yöntemle değerlendirilmelidir.

iAMO21/Ploidi Değerlendirmesi

ETV6::RUNX1 FISH analizinde RUNX1 sinyal sayısının artması iAMP21 açısından şüphe oluşturabilir. Klasik iAMP21 tanımı, hücre başına ≥5 RUNX1 sinyali ve metafazda tek bir anormal kromozom 21 üzerinde ≥3 ek RUNX1 kopyası bulunmasına dayanır. Hiperdiploidi/polizomi 21 benzer sinyal artışına yol açabileceğinden, şüpheli veya atipik olgularda metafaz FISH ve/veya laboratuvarın valide ettiği genomik kopya sayısı yöntemi ile doğrulama yapılabilir. Hipodiploid klonun genomik materyalini duplike etmesiyle oluşan “maskelenmiş hipodiploidi” şüphesinde ise SNP-array veya kopya sayısı ile heterozigozite kaybını birlikte değerlendirebilen genomik yöntemler tercih edilmelidir.

Hipodiploidi ve Germline Yatkınlık Değerlendirmesi

Hipodiploidi ve Germline Yatkınlık Değerlendirmesizellikle çocuk ve adölesanlarda düşük hipodiploid B-ALL saptanması germline TP53 yatkınlığı açısından değerlendirme gerektirebilir. TP53 ile birlikte klinik bağlama göre ETV6, PAX5, IKZF1 ve diğer kalıtsal ALL yatkınlık genleri de göz önünde bulundurulabilir. Germline doğrulama için hematopoietik kontaminasyonu en aza indiren uygun normal doku tercih edilmeli; kan/kemik iliği örneğindeki varyant tek başına germline kabul edilmemelidir.

IG/TR Klonal Hedef Analizi ve MRD Hazırlığı

LL tedavisinde yalnızca hastalığın başlangıçtaki genetik özelliklerinin belirlenmesi değil, tedaviye verilen yanıtın hassas şekilde takip edilmesi de önemlidir. Bu amaçla tanı sırasında immünoglobulin (IG) ve T-hücre reseptör (TR) gen bölgelerindeki hastaya özgü klonal değişiklikler belirlenebilir.

Akım sitometrik MRD ve moleküler IG/TR temelli MRD değerlendirmeleri, kullanılan tedavi protokolü ve laboratuvar validasyonuna göre ayrı veya tamamlayıcı yöntemler olarak planlanabilir. Tanıda saptanan bu klonal hedefler, uygun hastalarda tedavi sürecinde ölçülebilir rezidüel hastalık (MRD) takibi için kullanılabilir. Böylece tedavi sonrasında çok düşük düzeyde kalabilen lösemik hücrelerin moleküler düzeyde izlenmesine olanak sağlanır.

Bu nedenle IG/TR klonal hedef analizi Temel Panel rutin içeriğinde yer almaz; Plus Paneli kapsamında moleküler MRD hazırlığı amacıyla sunulur.

EuroMRD yaklaşımında IG/TR-temelli moleküler MRD için hedefe özgü duyarlılık ve kantitatif aralık tanımlanmalı; mümkün olduğunda yeterli duyarlılığa sahip iki bağımsız klonal hedef kullanılması tercih edilmelidir.

Takip, Refles ve Ek/İleri Değerlemdirmeler Nedir?

Bazı moleküler takip, refleks ve ek/ileri değerlendirmelerin tüm hastalara başlangıçta uygulanması gerekli değildir. Temel Paneli sonucuna, tedavi yanıtına veya ortaya çıkan klinik gereksinime göre bu testler takip sürecinde veya ikinci aşamada planlanabilir.

BCR::ABL1 Pozitif Hastalarda

BCR::ABL1 füzyonu saptanan hastalarda:

• BCR::ABL1 transkript tipi belirlenir,
• Tanı sırasında bazal kantitatif BCR::ABL1 düzeyi ölçülür,
• Tedavi süresince seri BCR::ABL1 RT-qPCR analizleri ile moleküler yanıt/MRD takibi yapılabilir.

BCR::ABL1 transkript temelli izlem ile akım sitometrik ve/veya IG/TR temelli MRD sonuçları seçilmiş olgularda tamamlayıcı olarak yorumlanabilir. BCR::ABL1 yükü ile lenfoblast yükü arasında belirgin uyumsuzluk, multilineage BCR::ABL1 varlığını düşündürebilir.

Tedavi sırasında yetersiz moleküler yanıt, BCR::ABL1 düzeyinde yeniden artış, tirozin kinaz inhibitörü (TKI) tedavisine direnç veya relaps gelişmesi durumunda BCR::ABL1 kinaz domeni (ABL1 TKD) mutasyon analizi yapılabilir. Sonuçlar mevcut TKI, saptanan mutasyonun direnç profili, BCR::ABL1 kinetiği ve klinik tablo ile birlikte yorumlanmalıdır. KML lenfoid blast fazı veya ICC kapsamındaki BCR::ABL1-pozitif multilineage B-ALL ayrımının klinik olarak önemli olduğu seçilmiş olgularda, BCR::ABL1’in granülositik/myeloid hücrelerde varlığı hedefe yönelik FISH veya uygun hücre ayrıştırma yaklaşımıyla değerlendirilebilir.

BCR::ABL1-Benzeri/Diğer B-ALL Şüphesi Devam Eden Hastalarda

BCR::ABL1-benzeri (Ph-like) B-ALL esas olarak gen ekspresyon profili ile tanımlanan biyolojik bir gruptur. RNA-NGS/WTS, ABL-class veya JAK-STAT yolak aktivasyonuna yol açan birçok füzyon/yeniden düzenlenmeyi gösterebilir; ancak negatif füzyon sonucu BCR::ABL1-benzeri biyolojiyi tek başına dışlamaz. RNA-NGS/WTS teknik olarak yetersiz olduğunda ve belirli bir moleküler yeniden düzenlenme şüphesi devam ettiğinde, ABL1, ABL2, PDGFRA, PDGFRB, CSF1R, CRLF2, JAK2, EPOR ve ilişkili hedefler için seçilmiş olgularda hedefe yönelik FISH veya alternatif valide RNA füzyon yöntemleri kullanılabilir. RNA-NGS/WTS teknik olarak yeterli olduğu halde BCR::ABL1-benzeri (Ph-like) veya başka bir moleküler alt tip şüphesi devam ediyorsa, valide gen ekspresyon sınıflayıcısı ve/veya gerektiğinde daha geniş yapısal varyant analizi/WGS değerlendirilebilir. DUX4-rearranged B-ALL gibi bazı alt tiplerde doğrudan füzyonun gösterilmesi güç olabileceğinden gen ekspresyon profili ve bütünleşik genomik bulgular sınıflamayı destekleyebilir.

Bütüncül Değerlendirme

B-ALL Temel/Plus Paneli ile klinik veya teknik gereksinime göre uygulanan takip/MRD değerlendirmeleri, refleks analizler ve ek/ileri moleküler incelemeler birlikte değerlendirildiğinde; hastalığın moleküler alt tipinin belirlenmesi, risk değerlendirmesi, hedeflenebilir genetik değişikliklerin araştırılması ve tedavi yanıtının moleküler olarak izlenmesi için bütüncül bir yaklaşım sağlanması amaçlanmaktadır. Her hastada tüm takip, refleks ve ek/ileri incelemelerin uygulanması gerekli değildir. Bu değerlendirmeler, başlangıç bulguları, tedavi protokolü, tedavi yanıtı ve hastanın klinik gereksinimleri doğrultusunda ilgili hekim ve laboratuvar uzmanları tarafından planlanır.