Секвенирование полного экзома (WES)

Что такое секвенирование полного экзома (WES)?

Секвенирование полного экзома (WES) — это технология секвенирования нового поколения (NGS), широко применяемая во всём мире и в нашей стране, которая позволяет исследовать «кодирующие белок участки» генома. Экзом включает все участки ДНК, используемые для синтеза белков в организме человека. Хотя экзом человека составляет менее 2% всего генома, именно в нём содержится около 85% известных вариантов, связанных с наследственными заболеваниями человека.

Секвенирование экзома проводится для выявления вариантов, расположенных в экзонах. Это метод, используемый для определения последовательности ДНК человека и выявления генетических заболеваний.

Как диагностируются генетические заболевания? Когда мы рекомендуем секвенирование экзома?

Для диагностики генетических заболеваний используются различные методы.

В первую очередь подробно собираются семейный анамнез и история заболевания пациента.
Одним из важных этапов диагностики является анализ распределения заболевания в родословной.
Затем проводится системный осмотр и оценка дисморфических признаков.
Также анализируются результаты всех исследований, выполненных до обращения в наш центр.
После комплексной оценки, при наличии предварительного клинического диагноза, планируются генетические исследования для проведения дифференциальной диагностики.

На этом этапе, если предполагается:

Если речь идёт о моногенном заболевании, приоритет отдается молекулярно-генетическим методам. Если после клинического обследования диагноз достаточно очевиден и известно, что заболевание связано только с одним геном, назначается исследование именно этого гена. Метод выбирается в зависимости от наиболее распространённого типа мутаций при предполагаемом заболевании. В одних случаях предпочтительно секвенирование гена, в других — сначала требуется исследование методом MLPA для выявления делеций и дупликаций. Выбор метода основывается на имеющихся данных о заболевании.

Однако в следующих случаях исследования одного гена недостаточно.

ногда установить диагноз непросто. Клинические проявления могут быть очень слабо выражены.
Симптомы могут быть неспецифичными и встречаться при многих различных заболеваниях.
Иногда заболевание очевидно, но его могут вызывать различные гены (по клинической картине невозможно определить конкретный тип заболевания).
У пациента имеется основное заболевание, но также присутствуют один или несколько дополнительных признаков, нехарактерных для него. Это может свидетельствовать о наличии сразу нескольких заболеваний.

В подобных ситуациях диагностика с помощью исследования только одного гена становится крайне затруднительной. Особенно при заболеваниях, связанных с множеством генов, последовательное исследование отдельных генов может оказаться значительно более дорогостоящим и длительным, чем проведение масштабного исследования, такого как секвенирование полного экзома (WES).

Именно в таких случаях предпочтение отдаётся методу секвенирование полного экзома (WES), который позволяет секвенировать все кодирующие участки примерно 20 000 генов.

Каковы преимущества метода WES?

Если у пациента имеется несколько заболеваний или дополнительное заболевание, влияющее на тяжесть основного, данный тест позволяет выявить их одновременно.
Если в медицинской документации часто встречается слово «атипичный», то есть имеются признаки, которые врачи не могут однозначно объяснить или связать с конкретным заболеванием, для этого всегда существует причина. Такой причиной могут быть мутации в генах-модификаторах, влияющих на клиническую картину, либо совершенно другая мутация в ином гене, вызывающая несколько заболеваний одновременно. Секвенирование экзома позволяет полностью выявить подобные случаи.
Особенно в нашей стране, где распространены близкородственные браки, наличие нескольких наследственных заболеваний у одного пациента не является редкостью. У некоторых пациентов может быть выявлено одновременно 4–5 различных заболеваний. Полученные результаты также имеют большое значение при планировании генетического обследования будущих детей в семье. При выполнении этого исследования супругам, состоящим в близкородственном браке, можно определить общие носительские варианты генов и на основании этих данных спланировать обследование при последующих беременностях.
Если клинические проявления пациента являются неспецифичными, то есть не указывают на конкретное заболевание, установить предварительный диагноз бывает сложно. Секвенирование экзома позволяет провести анализ всех генов и значительно повышает вероятность постановки точного диагноза.

Что даёт секвенирование полного экзома (WES)?

Секвенирование полного экзома (WES) — это исследование всех кодирующих участков ДНК (экзонов) в генетическом материале человека. Его основные преимущества:

Диагностика генетических заболеваний:
WES является эффективным инструментом для диагностики наследственных заболеваний. Особенно широко он применяется для выявления причин редких генетических заболеваний.

Выявление генетических факторов риска:
WES позволяет определять генетические факторы риска развития различных заболеваний и оценивать наследственную предрасположенность человека. Кроме того, в странах с высокой распространённостью близкородственных браков этот метод особенно полезен при подготовке к беременности. Он позволяет выявить общие патогенные варианты у супругов, а также оценить наличие патогенных вариантов, расположенных в Х-хромосоме у женщины. Это существенно снижает риск рождения ребёнка с аутосомно-рецессивными и Х-сцепленными заболеваниями. Также метод помогает выявлять наследственные заболевания у носителей с минимальными клиническими проявлениями.

Прогнозирование ответа на лекарственную терапию:
WES позволяет прогнозировать индивидуальную реакцию организма на некоторые лекарственные препараты с учётом генетических особенностей пациента, что способствует развитию персонализированной медицины.

Исследование онкологических заболеваний:
WES помогает изучать генетические изменения в опухолевых клетках, что способствует пониманию механизмов возникновения и прогрессирования рака. Эти данные используются для оценки наследственной предрасположенности к онкологическим заболеваниям и выбора персонализированной терапии.

Генетические исследования и новые открытия:
WES применяется для открытия новых генов и изучения генетических механизмов заболеваний. Это способствует развитию генетической науки и созданию новых подходов к диагностике и лечению наследственных заболеваний.

Как проводится секвенирование полного экзома (WES)? Как проходит процесс исследования?

Подготовка образца ДНК:

Для получения генетического материала у пациента берётся подходящий биологический образец (кровь, слюна, ткань).
В лаборатории из этого образца выделяется ДНК.

Обогащение экзома (Capture):

Экзоны, составляющие лишь небольшую часть генома, обогащаются с использованием специально разработанных наборов зондов или методов гибридизации.
Этот этап позволяет отделить экзонные участки от остального генома и провести их более глубокое секвенирование.

Секвенирование:

Обогащённые экзоны секвенируются с использованием технологий высокопроизводительного секвенирования.
Определяется последовательность пар оснований генетического материала, а полученные данные сохраняются в виде файлов.
Современные платформы секвенирования способны одновременно считывать миллионы пар оснований.

Анализ данных:

Полученные данные секвенирования анализируются с помощью специализированного программного обеспечения.
Выявляются генетические варианты, такие как точечные мутации, инсерции и делеции.
Полученные данные сравниваются с референсным геномом для выявления потенциально значимых генетических изменений.

Интерпретация и подготовка отчёта:

Проводится оценка клинической значимости выявленных генетических изменений.
В отчёте указываются генетические изменения, которые могут быть связаны с заболеванием.
Клинические специалисты интерпретируют результаты с учётом генетического профиля пациента.

Секвенирование полного экзома (WES) является мощной геномной технологией, используемой для изучения генетических заболеваний, выявления генетических факторов риска и развития персонализированной медицины.

Оценка результатов секвенирования экзома

Интерпретация результатов секвенирования экзома проводится с учётом современных научных данных, клинических проявлений пациента и семейного анамнеза.

Из примерно 20 500 генов человека на сегодняшний день известно около 8 000 генов, связанных с заболеваниями. Заболевания и клинические признаки, наблюдаемые у пациента, оцениваются с учётом опубликованных научных данных, а патогенность выявленных вариантов определяется с использованием in silico-инструментов прогнозирования (SIFT, PolyPhen-2, MutationTaster, MetaLR и др.) и критериев ACMG (American College of Medical Genetics).

В результате такого анализа становится возможным определить методы лечения при установлении диагноза, провести обследование членов семьи на наличие заболевания или носительства, а также предотвратить повторное возникновение заболевания при последующих беременностях.

В обычных условиях выполнение такого анализа занимает примерно 1–2 месяца.

АНАЛИЗ: Несмотря на то, что процесс может показаться простым, он требует глубоких знаний и большого практического опыта. Некоторые лаборатории используют готовые программы анализа. Однако их диагностическая эффективность ниже по сравнению с ручным анализом, выполняемым с учётом клинической информации. В нашем центре анализ проводится с использованием разработанного нами программного обеспечения, основанного на многолетнем опыте и клинических данных, в сочетании с ручной экспертной оценкой. Благодаря этому уровень диагностической эффективности нашего центра превышает среднемировые показатели.

КРАТКОЕ РЕЗЮМЕ:

Секвенирование экзома позволяет выявлять варианты в кодирующих участках любого гена, а не только заранее выбранных.
Метод эффективно выявляет новые мутации и носительство ранее неизвестных или трудно диагностируемых заболеваний.
Он позволяет принимать профилактические меры ещё до развития заболевания или начать лечение ранее не диагностированной болезни.
Метод обеспечивает эффективное выявление широкого спектра факторов риска, включая наследственные заболевания и генетическую предрасположенность к онкологическим заболеваниям.
Это одна из технологий секвенирования нового поколения, применяемая для диагностики неустановленных генетических заболеваний и состояний, связанных с большим количеством генов.
Интерпретация результатов секвенирования экзома требует точного анализа клинических проявлений пациента, комплексной оценки всей медицинской документации и определения генов-мишеней. Для этого необходимы глубокие знания в области геномики, биоинформатики и клинической медицины.
Кроме того, тест может использоваться для оценки наследственной предрасположенности к онкологическим заболеваниям, определения риска рождения ребёнка с наследственными заболеваниями у близкородственных супругов, а также выявления заболеваний, требующих клинического наблюдения.
Цель данного исследования — проанализировать около 20 000 генов за одно исследование, сократив при этом стоимость и сроки выполнения анализа.

Для проведения высококачественного анализа секвенирования экзома необходимы:

Высокое разрешение данных, полученных в лаборатории.
Подробная биоинформатическая обработка данных, контроль качества и выявление вариантов высокого риска.
Клиническая оценка результатов специалистом, имеющим опыт работы с пациентами.
Подтверждение полученных результатов, обследование членов семьи и дополнительная оценка патогенности выявленных вариантов с использованием дополнительных исследований (секвенирование РНК, Western Blot, рентгенография, биохимические исследования и др.).
Наличие статистических данных, накопленных самим центром.
Периодический повторный анализ данных пациентов без установленного диагноза или с сомнительными результатами с использованием актуальной научной литературы.

Пренатальное секвенирование экзома

Интерпретация результатов секвенирования экзома, выполняемого в рамках пренатальной диагностики для определения наличия заболевания у плода, требует ещё большего опыта. Исследование может проводиться при выявлении изменений на УЗИ плода или при наличии неустановленного наследственного заболевания в семье. Выявленные патогенные и вероятно патогенные варианты включаются в заключение. Анализируются многочисленные международные базы данных. Если обнаруживаются дополнительные изменения, способные повлиять на течение беременности, изменить тактику лечения или ухудшить клиническое состояние помимо уже выявленных изменений у плода, семья и лечащий врач подробно информируются, а соответствующая информация включается в отчёт. Подготавливается заключение, понятное как семье, так и врачу. По каждому результату обязательно проводится генетическое консультирование семьи.

Трио-экзом

Особенно при пренатальном секвенировании экзома, когда время имеет решающее значение, а также при обследовании пациентов с неустановленным диагнозом, выполнение трио-экзома (одновременное исследование матери, отца и ребёнка/плода) повышает вероятность постановки диагноза и сокращает сроки подготовки заключения.

Ранее после выявления аномалий при ультразвуковом исследовании плода диагностический алгоритм включал быстрое исследование хромосом, затем при нормальном результате проводился SNP-array для выявления микроделеций и микродупликаций, а при отсутствии изменений выполнялось секвенирование экзома для поиска точечных мутаций. Такой подход значительно увеличивал время диагностики.

Сегодня благодаря современным алгоритмам анализа данных WES выявление делеций и дупликаций стало возможным без обязательного использования SNP-array. Способность данного метода одновременно выявлять как моногенные заболевания, так и вариации числа копий (CNV) позволяет сократить сроки диагностики, снизить общую стоимость исследования и эффективно работать даже с небольшим количеством биологического материала.